باغچه را كاملاً با هم مخلوط و با اتوكلاو در دماي 121 درجه سانتي‌گراد، فشار 5/1 اتمسفر به مدت 20دقيقه استريل گرديد.
در مرحلة بعدي تعداد بذور حساس گوجه‌فرنگي در خاكهاي استريل كاشته و سپس از گذشت 25 روز گياه جوان(2-4برگي) جهت تكثير و تلقيح آماده گرديد.
سپس هر كيسه تخم را بطور جداگانه توسط پي‌پت مكيده و به داخل سوراخي به عمق cm 5ـ3 در مجاور ريشه يك نشاء گوجه‌فرنگي قرار گرفت. پس از تلقيح، اندكي آبياري انجام شد. پس از حدود 55 تا 60روز، ريشه‌هاي گوجه‌فرنگي آلوده، به منظور بررسي توليد گال و توليد مثل نماتد ارزيابي شد.
سرانجام نماتدهايي مشابه با نماتد آلوده كنندة اوليه، از گال‌هاي بوتة گوجه‌فرنگي جدا شد پس بر اساس اصول کخ، اثبات شد كه نماتد Meloidogyne عامل بيماري پسته است (تصوير 3-4)
( 1987, Jepson).

تصوير 3-4: علائم آلودگي به نماتد در بوته هاي گوجه فرنگي و ايجاد گال برروي ريشه بوته هاي گوجه
فرنگي

3-3- تهيه برش از شبكه كوتيكولي انتهاي بدن نماتدهاي ماده (perineal pattern)
براي شناسايي ماده‌هاي بالغ نماتد مولد غده ريشه از اختلاف نقوش كوتيكولي انتهايي بدن آن‌ها استفاده مي‌گردد و اين تفاوتها يكي از مهمترين وجوه تمايز گونه‌هاي مختلف جنس Meloidogyne است (Chitwood,1974).
كوتيكول در قسمت انتهايي بدن نماتد ماده به شكل اثر انگشت مي‌باشد و به نام perineal pattern معروف‌اند.
اگرچه اختلافات در شكل افراد يك گونه وجود دارد ولي خصوصيات اصلي به ميزان زيادي ثابت است، خصوصيات شكل اين شبكه، شامل شكل عمومي كلي، وجود يا فقدان شيارهاي مشخص در ناحية خطوط جانبي، نقطه نقطه بودن ناحيه انتهايي دم و شكل و فرم خطوط مي‌باشد.
در هر حال زماني كه اختلافات مابين گونه‌ها قابل توجه نباشد، تشخيص قطعي نبوده و به علت همپوشاني خصوصيات مرفولوژيك استفاده از ساير صفات تاكسونوميك الزامي است
(1985 Eisenback,).
به منظور تهيه برش از شبكه كوتيكولي انتهاي بدن نماتدهاي مادة بالغ از روش Jepson استفاده گرديد ( 1987 Jepson,)
ابتدا مقداري ريشة تازه مبتلا به نماتد مولد غده ريشه گوجه فرنگي را در يك ظرف آب نگهداري شد. قطعاتي از ريشه‌هاي گره‌دار را در داخل پتري، زير بينوكولر گذاشته و تعدادي گره را به وسيلة سوزن و اسكالپل پاره كرده و نماتدهاي بالغ ماده خارج شد. سپس روي سطح صاف شيشه‌اي، در زير بينوكولر، دو قطره اسيد لاكتيك %45 ريخته بعد بوسيلة اسكالپل بدن نماتد را به دو نيم مي‌كنيم بعد با قلم مو، قسمت انتهاي بدن نماتد را در روي قطرة اسيد لاكتيك %45 تكان داده تا محتويات داخل كوتيكول خالي شود( اسيد لاكتيك، جدا شدن اجزاء چسبيده به كوتيكول را آسان مي سازد).
بعد با دقت برش ديگر در برش قسمت انتهايي زده تا به صورت يك مربع كوچك، آرايش گردد. باز با قلم مو، محتويات روي شيارهاي كوتيكول را، خارج نموديم. سپس روي لام را يك قطرة گليسيرين گذاشته و قطعه مربعي بدست آمده را به روي قطرة گليسيرين، روي لام منتقل نموديم.
طوري قطعه روي لام گذاشتيم كه سطح خارجي آن قطعه، به سمت عدسي چشمي ميكروسكوپ و سطح داخلي قطعه، روي لام قرار گرفت.
سپس لاملي به آرامي روي قطره گليسيرين قرار داده شد و دور لامل نيز با لاك بيرنگ، محكم گرديد.
بدين ترتيب با تطابق دادن اسلايدهاي مقاطع تهيه شده با كليدشناسايي مي توان گونه‌هاي جنس نماتد Meloidogyne را شناسايي كرديم(تصوير3-5).

تصوير 3-5: مراحل تهيه شبکه کوتيکولي انتهاي بدن نماتد ماده از ريشه آلوده گوجه فرنگي

3-4-رنگ آميزي نماتد ماده و تخم هاي درون کيسه تخم
براي جداسازي آسانتر نماتد ماده از درون گال و مشاهده تخم ها درون کيسه تخم، رنگ آميزي انجام شد.
3-4-1- رنگ آميزي نماتد ماده
ابتدا ريشه هاي شسته شده را به قطعات کوچکتر تقسيم کنيم.سپس ريشه ها را درون محلول رقيق هيپوکلريت سديم به مدت 4 دقيقه در حرارت، بي رنگ شد.بعد ريشه ها را با آب شسته،تا رنگ بر خارج شود.در اين مرحله ريشه ها را در محلول اسيد فوشين – اسيد استيک، حرارت داده تا نماتد ماده در ريشه،رنگي شد.مکرراً ريشه ها را با آب شسته و با هيپوکلريت سديم بيرنگ مي کنيم.سر انجام نماتد ماده به رنگ قرمز مشاهده شد.

3-4-2- رنگ آميزي تخم درون کيسه تخم
ريشه هاي حاوي کيسه تخم را درون محلول فلوکسينB، به مدت 15 دقيقه قرار داده شد.سپس تخم هاي درون کيسه تخم،به رنگ ارغواني در آمد.
3-5- جداسازي نماتدهاي نر از خاك
براي جداسازي نماتد نر از روش الك و سانتريفوژ ( Jenkins, 1964 ) استفاده شد. در اين روش، ابتدا ذرات درشت سنگ را از نمونه‌هاي خاك جدا نموده سپس مقداري خاك را در يك تشت پلاستيكي ريخته و دو برابر حجم خاك، در داخل ظرف، آب اضافه نموده و سپس آب و خاك را كاملاً با هم مخلوط گرديد، تا نماتدها از لابه‌لاي ذرات خاك خارج شده و در آب شناور شدند.
چندثانيه محلول را به حال خود رها كرده تا املاح سنگين ته نشين شوند سپس به آرامي محلول فوق را به تشت دوم انتقال داديم( فقط آب بالاي املاح ته‌نشين شده به تشت دوم منتقل شد).
در اغلب موارد، محتويات تشت دوم حاوي ريشه‌هاي درشت و مواد زائد مي‌باشد بنابراين براي جداسازي اين مواد اضافي و زايد، محلول فوق را از الك 20مش عبور داده تا اين مواد از محلول جدا كرديم. براي اطمينان از جداشدن نماتدها از مواد زائد، سطح الك 20مش را با فشار آب شسته شد و آب حاصل از شستشو به محلول بدست آمده اضافه شد.
سپس محلول را به ترتيب از الكهاي 60مش (250)، 100 مش (150)، 200 مش (75)، و 400 مش (38)، عبور داده شد.
در مرحلة بعدي مواد باقي مانده در سطح الك 200 مش و 400 مش را با پي‌ست شسته و در داخل ظرفي ريخته و سپس محتويات ظرف را به يك مزور 500 ميلي‌ليتري منتقل گرديد.
45دقيقه مزور را به حال خود رها كرده تا نماتد و املاح رسوب كرد. پس از اين مدت نماتدها و املاح رسوب نمود و مواد زايد سبك در روي آب شناور گرديد. سپس مواد زايد سبك روي آب سطح رسوب را به آرامي و به همراه آب‌رويي، از سطح مزور خارج مي كنيم.
در اين مرحله محلول داخل مزور را به هم زده، سپس به مقدار مساوي داخل لوله‌هاي سانتريفوژ تقسيم گرديد، محتويات درون لوله‌ها در دو مرحله سانتريفوژ گرديده كه به شرح زير است:

مرحلة اول:
ابتدا به مدت 5 دقيقه با سرعت 3800 تا 4000 دور در دقيقه ( بسته به نوع خاك) انجام گرفت كه در اين مرحله ذرات خاك و نماتد از آب جدا شده و در ته لوله سانتريفوژ ته‌نشين گرديد. سپس آب رويي را به آرامي خارج مي‌كنيم.

مرحلة دوم:
در اين مرحله جهت شناور نمودن نماتدها، از محلول شكر استفاده شد. براي تهية محلول شكر، داخل يك مزور به ميزان 700 ميلي ليتر آب ريخته و سپس شكر را به مزور اضافه كرده تا حجم آن به 1000 ميلي ليتر برسد.
سپس محلول شكر را كاملاً با رسوبات داخل لوله‌هاي سانتريفوژ به هم زده و در نهايت به مدت يك دقيقه، با سرعت 1000 دور در دقيقه سانتريفوژ انجام شد.
در اين مرحلة سانتريفوژ، نماتدها در آب روي لوله‌ها شناور مي شوند. در نتيجه آب رويي لوله‌ها را سريعاً در زير آب ملايم، از الك 400 مش(38)، عبور داده شد.
بدين ترتيب نماتد در سطح الك جمع شدند. لازم بذكر است نبايد فاصلة زماني بين اضافه كردن محلول شكر تا شستشوي آن از نماتدها، طولاني باشد زيرا در غير اين صورت، منجر به چروكيدگي نماتدها مي شود.
سپس محتويات سطح الك 400 مش را با فشار آب پي‌ست، شسته و در داخل پتري ريختيم. بدين ترتيب نماتدها به همراه آب وارد پتري شدند و محتويات پتري را به داخل شيشه مكارتي در دار منتقل كرديم، روي هر شيشه دردار نمونه، شماره گذاري شد.
3-6- تهيه لاروهاي سن دوم:
كيسه‌هاي تخم مربوطه به هر نماتد ماده‌اي كه از آن برش تهيه شد، در آب مقطر استريل درون پتري قرار گرفت.
پس از مدت 48ـ24 ساعت در انکوباتور در دماي 25 درجه سانتيگراد، لاروهاي سن دوم بتدريج تفريخ شد كه از آنها براي تهيه پرپاراسيون موقت و دائم مي‌توان استفاده شد(1985 Barker et al,).
سپس بررسي مشخصات مرفولوژيك لاروهاي سن دوم شامل طول كل بدن، طول دم، طول منطقه شفاف ناحيه دم، طول استايلت و همچنين بررسي‌هاي مرفولوژي دم،انجام شد.
3-7- تهيه اسلايدهاي ميكروسكوپي از نماتدها
جهت بررسي‌هاي ميكروسكوپي با توجه به نوع بررسي، مي‌توان اسلايدهاي ميكروسكوپي موقتي و يا دائمي، به شرح زير از نماتدهاي جمع‌آوري شده تهيه گرديد.
3-7-1- تهيه اسلايد موقت
به دليل اينكه بعضي از اندام‌هاي بدن نماتدها در حال زنده بهتر و مشخص‌تر از حالت ثابت شده قابل رؤيت مي‌باشد، از اسلايد موقت استفاده گرديد. براي انجام اين عمل يك قطره كوچك آب وسط يك لام تميز قرار داده و به كمك يك سوزن ظريف نماتدها را در زير بينوكولر از ظرف محتوي نماتدها برداشته و به قطره آب منتقل و سپس چند قطعه كوچك پشم شيشه هم قطر نماتدها قرار داده و سپس به آرامي و به ملايمت لامل را روي قطره آب قرار داده و اطراف لامل را با چسب مسدود گرديد. براي بي‌حركت نمودن نماتدها بهتر است لام قبل از زدن چسب زدن، روي شعله چراغ الكلي كمي حرارت داده شود.
3-7-2- تهيه اسلايد دائمي:
براي نگهداري نماتدها به مدت طولاني و تهيه پرپاراسيون دائم لازم از روش تكميل شده دگريسه (, 1969 DeGrisse) استفاده گرديد. جهت انجام اين روش پس از تهيه لاروهاي سن دوم و استخراج نماتد نر و انتقال نماتدها به داخل شيشه‌هاي مكارتي و ته‌نشيني كامل نماتدها پس از گذشت حدود 45 دقيقه توسط يك پيپت بسيار نازك آب اضافي شيشه‌ها چنان كشيده شد كه حدود پنج سي‌سي مخلوط آب و نماتد در شيشه باقي ماند، براي انجام اين عمل از يك شيشه هم شكل و اندازه كه ميزان حدود پنج سي‌سي از قبل روي آن تعيين و علامت‌گذاري شده بود، استفاده گرديد. اين كار باعث مي‌گردد تا هنگام خارج كردن آب اضافي، ميزان خارج شدن نماتدها به همراه آب به حداقل برسد. آب خارج شده براي اطمينان بيشتر از وجود يا عدم وجود نماتد در آن، در زير بينوكولر بررسي شد و در صورت وجود نماتد، با يك سوزن مخصوص نماتدها برداشته شده و به شيشه منتقل شدند. بعد از اين مرحله پنج سي‌سي از محلول فيكساتيو دو غلظتي با فرمول 44 قسمت آب مقطر، 10قسمت فرمالين 40درصد يك قسمت اسيداستيك و يك قسمت گليسيرين را تا گرم نموده و روي
پنج سي‌سي محلول نماتدها ريخته شد. نماتدها ضمن كشته شدن در محلول فيكساتيو يك غلظتي قرار گرفتند.
جهت انتقال نماتدها به گليسيرين خالص، ابتدا محتويات شيشه مكارتي به يك پتري كوچك و سپس در يك محيط الكلي اشباع( درون دسيكاتور محتوي الكل) در انكوباتور با دماي به مدت 24 ساعت قرار داده شد. بعد از 24 ساعت، پتري را بيرون آورده، محلول فيكساتيو در زير بينوكولر توسط يك پيپت ظريف خارج گرديد، سپس محلول دوم با فرمول 95 قسمت الكل اتيليك 96درصد و 5 قسمت گليسيرين اضافه گرديد و به مدت 4 ساعت در همان شرايط در انكوباتور قرار داده شد. بعد از اين مدت مجدداً پتري از انكوباتور خارج و محلول اضافي دوم با همان روش اشاره شده تخليه گرديد و سپس محلول سوم با فرمول 50 قسمت گليسيرين و 50قسمت الكل اتيليك 96درصد به پتري اضافه گرديد و به انكوباتور با دماي به مدت 4 ساعت و برخلاف مراحل قبلي بدون قرار دادن در محيط الكلي اشباع و به طور روباز در انكوباتور قرار داده شد. در طي اين مدت الكل تبخير شده و نماتدها در گليسيرين خالص باقي ماندند. براي جلوگيري از جذب رطوبت توسط گليسيرين تا زمان تهيه پرپاراسيون دايمي از

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید