نماتدها، پتري‌هاي حاوي نماتدها به يك دسيكاتور محتوي كلرور كلسيم منتقل شدند.
براي تهيه اسلايد ابتدا پتري حاوي گليسيرين و نماتدها در زير بينوكولر مشاهده و نماتدهاي مربوط به جنس Meloidogyne به طور جداگانه توسط سوزن مخصوص شكار به قطرات گليسيرين روي يك لام منتقل شدند. براي كنترل انتخاب صحيح نماتدها قطرات روي لام در زير ميكروسكوپ با بزرگنمايي x10 مشاهده گرديدند و در صورت وجود نماتد يا نماتدهايي از گروههاي ديگر به طور اشتباه مجدداً در زير بينوكولر جدا گرديد. پس از اينكه تعداد نماتدها در هر قطره گليسيرين به حد كافي رسانده شدند آماده انتقال به قطره گليسيرين وسط حلقه پارافين مي‌باشند. براي تهيه حلقه پارافين توسط دهانه يك ميله فلزي توخالي يا لوله آزمايش كه قطرش كمتر از عرض لام باشد در وسط يك لام تميز ايجاد حلقه پارافين گرديد. بدين صورت كه ابتدا ميله يا دهانه لوله آزمايش روي شعله چراغ الكلي حرارت داده شدو سپس به طور مستقيم در پتري محتوي پارافين جامد فرو برده شده و سريعاً در وسط لام گذاشته شد. پس از برداشتن ميله يا لوله آزمايش حلقه پارافين در وسط لام ايجاد مي‌گردد. سپس يك قطره كوچك گليسيرين در وسط حلقه پارافين روي لام گذاشته شد.
بعد از آماده شدن حلقه پارافين در زير بينوكولر نماتدهاي مربوط به جنس Meloidogyne با تفكيك لاروسن دوم يا نماتد نر با استفاده از سوزن ظريف سركج به قطره كوچك گليسيرين وسط حلقه پارافين انتقال داده شد، سپس اين لام در زير بينوكولر مشاهده گرديد و پس از آرايش و مرتب كردن نماتدها از لحاظ خوب قرار گرفتن در گليسيرين و عدم روي هم افتادگي آنها يك لامل تميز به آهستگي روي آن قرار داده شد و سپس لام مزبور روي چراغ الكلي به ملايمت حرارت داده شد تا پارافين ذوب گردد و سطحي از لام كه زير لامل قرار دارد كاملاَ بپوشاند. در اين هنگام لام را روي يك سطح صاف قرار داده تا پارافين به طور يكنواخت سخت گردد، سپس جهت اطمينان اطراف لامل را با لاك بيرنگ پوشانده شد تا از نفوذ هوا به داخل اسلايدها جلوگيري به عمل آيد. سپس در دو طرف لام برچسب نصب شد و در يك طرف مشخصات نماتد( اسم جنس، گونه، نر يا ماده بودن و تعداد آنها) و در طرف ديگر شماره اسلايد، منطقه جمع‌آوري، نام ميزبان، تاريخ و نام تهيه كننده اسلايد ثبت گرديد. از اين اسلايدها براي مطالعات مورفومتريك و عكسبرداري استفاده به عمل آمد.

3-8- تعيين شدت آلودگي بر اساس تعداد گال در پنج گرم ريشه پسته
ابتدا ريشه هاي پسته جمع آوري شده را درون الک گذاشته و به آرامي با آب شسته تا خاک ها از اطراف ريشه خارج شد.دو ساعت ريشه هاي شسته شده را به حال خود رها نموده تا رطوبت اضافي را از دست داد. پس از شستشوي ريشه هاي پسته جمع آوري شده، سپس ريشه ها 15-10 دقيقه در محلول رنگي فلوکسين 5 درصد رنگ آميزي شدند.سپس بر اساس سيستم پيشنهادي تيلور وساسر (1978) (جدول 3-1) شاخص گال مشخص شد .

جدول 3-1:درجه بندي اندکس گال براساس تعداد گال (Taylor and Sasser, 1978)

شدت آلودگي
تعداد گال
شاخص(index)
فاقد آلودگي
بسيار کم
کم
متوسط
شديد
بسيار شديد
بدون گال
2-1
10-3
30-11
100-31
100
O
1
2
3
4
5

فصل چهارم
نتايج و بحث

4-1- نتايج
4-1-1- شناسايي گونه‌هاي نماتد مولد غده ريشه پسته
در اين بخش با استفاده از كليد جپسون Jepson(1987) در رابطه شناسايي نماتد مولد غده ريشه، جنس Meloidogyne spp با تهيه برش از شبكه كوتيكولي انتهاي بدن نماتدهاي ماده بالغ و تهيه اسلايدهاي ميكروسكوپي دائم از نماتدهاي نر بالغ ولاروهاي سن دوم، اقدام به اندازه گيري آنها شد.
با توجه به موقعيت تقريبي مخرج و شكاف ولوا و فرم نقش كوتيكولي و اندازه‌گيري طول و عرض بدن نماتد ماده بالغ نيز با توجه به طول و شكل استايلت و طول و عرض بدن در نماتد ماده بالغ، و اندازه گيري طول بدن و اسپيکول و حباب مياني مري و عرض گره استايلت و استايلت و گوبرناکلوم و DGO نماتد نر بالغ، همچنين با توجه به طول قسمت شفاف انتهاي دم لاروسن دوم و طول بدن و استايلت و دم آن، گونه M. javanica در مناطق مختلف باغات پسته، تشخيص داده شد.
از 40 نمونه جمع آوري شده از باغات پسته مناطق مختلف شهرستان سبزوار، 32 نمونه ، آلوده به نماتد مولد غده ريشه گونه M.javanica تشخيص داده شد و هيچكدام از گونه‌هاي ديگر مشاهده نگرديد.
در برش‌هاي تهيه شده از انتهاي بدن نماتد ماده از روي شبكه كوتيكولي انتهاي بدن M.javanica تشخيص داده شد.
تشخيص نماتدها همچنين برپايه مرفولوژي و مرفومتري استوار است. اين روش سريع و كاربردي و يا امكانات محدود انجام مي‌شود. يك ميكروسكوپ نوري با كيفيت مناسب و كمي تجربه امكان تشخيص دقيق و مطمئن بيشتر جمعيت‌ها را به ما مي‌دهد.
اگرچه ممكن است براي شناسايي گونه‌هاي يك جمعيت، يك يا دو جفت صفت مرفولوژيكي مورد ارزيابي قرار گيرد، ولي براي اطمينان و دقت در تشخيص، از صفات بيشتر و تعداد نمونه بيشتري براي شناسايي و رده بندي نماتدها بايد استفاده كرد.
تشخيص اين نتايج كاملاً بر اساس خصوصيات مرفولوژيكي و مرفومتري انجام شد.
تشخيص دقيق جمعيت نماتدهاي ريشه گرهي در حد گونه و نوع ميزبان به صورت اساسي و اصولي جهت كنترل موثر و تحقيق دقيق تر آنها صورت مي‌گيرد بسياري از گونه‌هاي Meloidogyne به راحتي از طريق محدود كردن دامنه ميزبان، و از طريق مشخصات مرفولوژيكي مشخص و به صورت واضح تشخيص داده مي‌شوند.
4-1-2- مشخصات جنس Meloidogyne Goeldi,1892
اين جنس به خانواده Hetroderidae و زير خانواده Meloidgyninae تعلق دارد. در افراد اين جنس كوتيكول در همه مراحل رشدي نر و ماده شياردار است. شبكه كوتيكولي سر با ر شد متوسط و بخشهاي جانبي آن (Lateral sectors) به اندازه يا عريض‌تر از بخشهاي مياني هستند.

4-1-2-1- مشخصات ماده
بدن ماده هاي بالغ تقريباًکروي که در قسمت جلو داراي گردني است که به تدريج به طرف سر باريک مي گردد و شکل عمومي بدن گلابي شکل مي باشد و قسمت انتهاي بدن گرد ويا ممکن است در ناحيه شبکه کوتيکولي انتهاي بدنperineal pattern)) کمي برآمده باشد. فاسميدها مشخص ومعمولا”دروسط سطوح جانبي ديده مي شوند.
استايلت باريک و بخش مخروطي آن از طرف پشتي کمي خميدگي دارد که از خصوصيات اين گونه محسوب مي گردد و داراي گره هاي انتهايي گرد مي باشد که کمي به طرف پايين متمايل بوده و فاصله محل ريزش غده پشتي مري تا گره استايلت 4.3 ميکرومتر است.حباب مياني مري کروي ،به طول 35.2 تا 43.7 و عرض آن 31 تا 39 ميکرومتر و داراي دريچه هلالي شکل بزرگي در مرکز مي باشد.طرح شبکه کوتيکولي انتهاي بدن به علت داشتن دو شيار موازي در سطوح جانبي ،که شيارهاي عرضي بدن را به طور مشخص به دو بخش پشتي و شکمي تقسيم مي نمايد(به طوريکه کمتر خطي از ناحيه پشتي به ناحيه شکمي امتداد مي يابد) از خصوصيات بارز اين گونه محسوب مي گردد که آن را از ساير گونه هاي اين جنس متمايز مي سازدشيار هاي طولي سطوح جانبي تقريباً در تمام پهناي شبکه کوتيکولي انتهاي بدن ،امتداد داشته و قبل از رسيدن به ناحيه دم،قطع مي شود.دو خط موازي سطوح جانبي فقط در ناحيه Perineal pattern به خوبي هويدا است.شبکه کوتيکولي انتهاي بدن به اشکال گرد تا بيضي و اندازه کمان پشتي،34-19 ميکرومتر است.شيار هاي ناحيه پشتي اين شبکه از گرد و کوتاه تا کمي بلند و گاهي خوابيده مشاهده مي گردد ،اين شيارها در فاصله بين فرج و مخرج ديده نميشود.در دو طرف شکاف تناسلي خطوط کوتاه و نامنظم و در انتهاي دم،خطوط شکسته ،موجي يا حلقوي ناپيوسته اي به چشم مي خورد(تصوير 4-1) (تصوير4-2)( تصوير4-3)(تصوير4-4)(جدول4-1).

تصوير4-1: برش انتهاي بدن نماتد ماده بالغ( perineal pattern )M.javanica جدا شده از باغات پسته شهرستان سبزوار

تصوير4-2 ماده بالغ نماتد M. javanica. سر و مري در نماتد بالغ ماده(تصوير بالا)و شکل هاي مختلف نماتد ماده بالغ(تصوير پايين) جدا شده از باغات پسته شهرستان سبزوار

تصوير4-3: تصوير ميکروسکوپي از انتهاي بدن نماتد ماده بالغ (Perineal Pattern) M. javanica از باغات پسته شهرستان سبزوار

تصوير 4-4: تصاوير ميکروسکوپي از نماتد ماده بالغ M. javanica از باغات پسته شهرستان سبزوار.A نماتد ماده بالغ B ناحيه سر و مري نماتد بالغ ماده

جدول 4-1: مشخصات مورفومتريک 20 نمونه نماتد ماده M . javanica در 10 نمونه مورد آزمون(اندازه به ميکرون)

مشخصات
حداقل
حداکثر
ميانگين
طول بدن
485
790
668.2
عرض بدن
320
490
416
طول استايلت
12.5
16.7
14.4
عرض گره استايلت
2.5
3.2
2.6
عرض حباب مياني مري
31
39
35.3
طول حباب مياني مري
35.2
43.7
39.7
4-1-2-2- مشخصات نر
نماتدهايي کرمي شکل داراي بدني بلند، با دو انتهاي گرد هستند.شبکه کوتيکولي سر کاملاّ قوي است.استايلت قوي، قسمت مخروطي آن بلندتر از قسمت استوانه اي و گره هاست. قسمت استوانه اي استايلت در محل اتصال به گره ها کمي پهن تر است.گره هاي استايلت مشخص و درشت است.فاصله گره استايلت تا محل ريزش ترشحات غده پشتي مري، ميانگين 85/2 ميکرون است.حباب مياني مري رشد کرده است و داراي دريچه بزرگ است. روزنه ترشحي مشخص ،در نزديکي انتهاي مري،ديده مي شود.هميزونيد مشخص و حدود يک شيار عرضي بالاتر از منفذ ترشحي قرار گرفته است. سطوح جانبي داراي 4 شيار طولي است که دو شيار طولي خارجي داراي دندانه هاي ظريفي است، در حاليکه دو شيارهاي طولي داخلي فاقد دندانه است. اسپيکول کمي از سمت شکمي خميده و گوبرناکولوم کوچک و هلالي شکل است. (جدول 4-2) (تصوير4-5) .

تصوير4-5: قسمتهاي مختلف نماتدنر ولارو سن2 M . javanica،جدا شده از باغات پسته شهرستان سبزوار.
A -سر ومري در نماتد نر
B -اسپيكول ودم درنماتدنر
C – ابتداي بدن در لارو سن2
D-دم در لارو سن2
جدول 4-2: مشخصات مورفومتريک20 نمونه نماتد نر M . javanica در 10 نمونه مورد آزمون(اندازه به ميکرون )

مشخصات
حداقل
حداکثر
ميانگين
طول بدن

885
1190
1091
نسبت طول بدن به بزرگترين عرض بدن(a)
40.7
53
45.3
نسبت طول بدن به طول مري(b)
6.7
7.1
6.8
نسبت طول بدن به طول دم(c)
40.5
49
46.2
عرض گره استايلت
3.3
4.2
3.41
عرض حباب مياني مري
8.2
11.3
9.8
طول حباب مياني مري
17.5
24.1
22.2
طول اسپيکولها
16.2
22.5
20.3
طول هادي آلت نري(Gubernaculum)
5.5
7.1
6.3
فاصله گره استايلت تا محل ريزش غده پشتي(DGO)
2.25
4.65
2.85
طول استايلت
16.8
22
19.5

4-1-2-3- مشخصات لارو سن دوم
نماتدهاي کوچک و کرمي شکل با بدني باريک که انتها به دم مخروطي، ختم مي شود. کوتيکول داراي شيار هاي ظريف است. استايلت ظريف و گره هاي گرد که کاملاّ مشخص نيست. سطوح جانبي داراي 4 شيار طولي است که دو شيار طولي خارجي داراي دندانه و دو شيار طولي داخلي فاقد دندانه است. شيار هاي عرضي کوتيکول به طرف انتهاي بدن، درشت تر شده اند. هميزونيد مشخص و درست قبل از روزنه ترشحي قرار گرفته است.از اين جنس گونه M.javanica از منطقه مورد بررسي جمع‌آوري و شناسائي شد (جدول 4-3).

جدول 4-3: مشخصات مورفومتريک 20 نمونه لارو سن دو M . javanica در 10 نمونه مورد آزمون(اندازه به ميکرون )

مشخصات

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید